Desenvolvimento e avaliação in vivo do mutante de deleção MGF100-1R em uma cepa chinesa do vírus da Peste Suína Africana

A peste suína africana (PSA) é uma doença infecciosa grave que acomete suínos domésticos e javalis, causada pelo vírus da peste suína africana (VPSA). A Organização Mundial de Saúde Animal (OIE) a lista como uma das doenças animais legalmente relatadas. Suínos domésticos de todas as raças e idades são suscetíveis ao VPSA.

 

Suas infecções agudas ou subagudas são caracterizadas por febre alta e sangramento sistêmico como principais características clínicas para que a mortalidade possa chegar a 100% (Arias et al., 2018; S´ anchez-Cordon ´ et al., 2018).

O VPSA é um vírus grande de DNA nucleoplasmático com uma estrutura de envelope de dupla camada e é o único membro pertencente ao gênero Asfivirus dentro da família Asfarviridae (Alonso et al., 2018). A estrutura do genoma é um DNA linear de fita dupla em torno de 170–198 quilobases (kb) (Dixon et al., 2013), contendo 151–186 quadros de leitura aberta (ORFs). O genoma do VPSA é organizado e lido bidirecionalmente (Forth et al., 2019). Poucas dessas proteínas foram estudadas em detalhes. O genoma consiste em uma região conservada de 125 kb no meio e uma região variável de ~ 35 kb na extremidade esquerda e ~ 15 kb na extremidade direita. Estas duas regiões contêm cinco grupos de famílias multigênicas (MGFs) que foram implicados na regulação das respostas imunes e especificidade do hospedeiro, incluindo grupos MGF360, MGF110, MGF505 / 530, MGF300 e MGF100 (Rodriguez et al., 1994a, b; Yozawa et al., 1994). Os papéis individuais dos MGFs no processo de infecção viral não foram bem estudados.

A maioria dos isolados do VPSA contém a família de genes MGF100, incluindo pelo menos 4 genes diferentes:

  • MGF100-1L, I7L e I8L estão localizados na região variável terminal direita,
  • e apenas MGF100-1R está localizado na região variável terminal esquerda (Vydelingum et al., 1993).

Embora as funções desses genes MGF100 sejam bastante desconhecidas, I7L e I8L foram considerados genes não essenciais.

A deleção do gene I8L não alterou a replicação do vírus e a virulência em suínos.

No entanto, em estudo recente, a deleção do agrupamento gênico de I7L para I11L mostrou redução significativa da virulência em suínos (Zhang et al., 2021). O gene MGF100-1R é altamente conservado e transcrito como um gene inicial durante o ciclo de replicação do vírus e a atividade transcricional do gene aumenta gradualmente em 18 h.

Neste relatório, após a deleção do gene MGF100-1R, a replicação e as propriedades patogênicas do vírus mutante foram avaliadas in vitro e in vivo, respectivamente.

Material e métodos 

Macrófagos derivados da medula óssea primários (BMDMs) foram coletados das cavidades medulares de leitões com 40 dias de idade, conforme descrito anteriormente (Zhang et al., 2021), que devem estar livres de doenças infecciosas suínas comuns com detecção de VPSA, peste suína clássica vírus (VPSC), vírus da pseudo-raiva suína (PRV), circovírus suíno tipo 1 e 2 (PCV-1/2), síndrome reprodutiva e respiratória suína (PRRSV) e parvovírus suíno (PPV) pelos métodos das Normas Nacionais (Shanghai).

Leitões com cerca de 15-20 kg foram adquiridos em Shanghai com alto padrão de biossegurança e higiene. Vírus suínos comuns foram testados por métodos de PCR ou qPCR. VPSA △ MGF100-1R foi avaliado quanto ao seu fenótipo de virulência em relação ao vírus VPSA GZ201801 parental virulento. Grupos de leitões (n = 3) foram desafiados com vírus VPSA △ MGF100-1R ou o vírus de tipo selvagem intramuscularmente (IM) a uma dose de 104 TCID50. Os leitões inoculados com VPSA foram monitorados quanto à temperatura retal e outros sintomas clínicos foram registrados de acordo com o sistema de pontuação clínica, conforme descrito anteriormente (King et al., 2011). Amostras clínicas de soro, sangue total anticoagulado com heparina, zaragatoas orais, zaragatoas nasais e zaragatoas anais foram recolhidas 0-7, 9, 11, 15, 21 e 28 dias após a inoculação (dpi) para detecção do vírus.

Após avaliação clínica, os leitões foram eutanaziados por injeção de pentobarbital sódico e, em seguida, submetidos a exame de necropsia  30 dpi. Órgãos e tecidos, incluindo amígdala, fígado, baço, rim, coração, pulmão, fígado, estômago, duodeno, jejuno, íleo, ceco, cólon, reto, pâncreas, baço, rim, timo, bexiga, músculo esquelético, cérebro e linfonodos dos leitões eutanaziados ou sobreviventes que foram sacrificados no final do período de observação foram pontuados usando o sistema de pontuação bruto conforme descrito anteriormente (Galindo-Cardiel et al., 2013), e 100 mg das amostras indicadas foram homogeneizadas por Tissuelyser -FEII (Shanghai Jingxin Co. Ltd, Shanghai, China) em 800 μl de PBS suplementado com Pen-strep a 1% para a detecção de título de vírus pelo ensaio TCID50.

Resultados 

O gene MGF100-1R é conservado em diferentes isolados de VPSA e transcrito como um gene viral inicial

O VPSA tem pelo menos 4 genes diferentes da família MGF100, incluindo MGF100-1R, MGF100-1L, I7L e I8L.

  • MGF100-1L, I7L e I8L estão localizados na região variável do terminal 3 ‘, e
  • apenas MGF100-1R está localizado na região variável do terminal 5′.

O gene MGF100-1R codifica 125 resíduos de aminoácidos e está posicionado na fita positiva nas posições entre 11.094 nt e 11.468 nt do genoma do vírus ASFV GZ201801 . O gene MGF100-1R é altamente conservado em diferentes isolados do VPSA.

Por análise de RNA-seq, MGF100-1R mostrou um alto nível de transcrição dentro de 3 hpi e manteve um alto nível de transcrição de 6 a 18 hpi.

Construção do mutante de deleção do gene MGF100-1R

O mutante de deleção ASFV △ MGF100-1R foi obtido com sucesso por recombinação homóloga por meio de co-transfecção com o vetor pUC △ 1R e, em seguida, infecção com vírus de tipo selvagem GZ201801. O sequenciamento de próxima geração mostrou que o CDS MGF100-1R foi substituído por um gene repórter EGFP sob o controle do promotor do gene tardio p72 ASFV. O mutante de deleção foi purificado até a homogeneidade por rodadas sucessivas de purificação de placa e ensaio de diluição limitante. Finalmente, as células BMDM estavam quase 100% infectadas com o mutante de deleção purificado. Para garantir a ausência do vírus parental GZ201801 e a deleção desejada em cada vírus recombinante, os DNAs virais foram extraídos e identificados por PCR. Nenhum amplicon foi gerado com os primers específicos direcionados à sequência MGF100-1R CDS, indicando a falta de contaminação do estoque de vírus ASFV △ MGF100-1R com o vírus parental GZ201801.

  • Os resultados mostraram que MGF100-1R era um gene não essencial e poderia ser facilmente excluído.

É possível que a função do gene MGF100-1R possa ser compensada por outros genes VPSA. Isso prova que o gene MGF100-1R é um gene não essencial sem afetar a replicação do VPSA.

Para avaliar o efeito de MGF100-1R na expressão de citocinas pró-inflamatórias, os níveis de mRNA de IL-6, TNF-α, IFN-α, IFN-β e IFN-γ induzidos por VPSA GZ201801 ou ASFV △ MGF100-1R foram detectados por qPCR em pontos de tempo indicados. Os resultados mostraram que os níveis de mRNA de IL-6, TNF-α, IFN-α, IFN-β e IFN-γ em células BMDM infectadas com VPSA △ MGF100-1R foram significativamente menores do que os de GZ201801 infectados. Além disso, a análise de qPCR indicou que a superexpressão de pHA-1R em células HeLa ativou significativamente a expressão de IL-6, TNF-α, IFN-α, IFN-β e IFN-γ (Fig. 2D).

Estes resultados sugeriram que o VPSA MGF100-1R regula positivamente as citocinas celulares durante a infecção por VPSA.

Conclusão
  • O VPSA codifica mais de 150 proteínas virais, que podem interagir com as proteínas do hospedeiro para escapar dos mecanismos de defesa da célula hospedeira e facilitar a replicação do vírus.
  • Em nosso estudo, VPSA GZ201801 sem o gene MGF100-1R induziu uma diminuição significativa nos níveis de citocinas quando a infecção por VPSA.

Consistente com isso, a expressão transitória da proteína MGF100-1R ativou significativamente o nível de transcrição de citocinas pró-inflamatórias nas células HeLa.

MGF100-1R pode ser um gene regulador de citocinas celulares no processo de infecção por VPSA.

O genoma do vírus da peste suína africana codifica cinco famílias MGF, e as regiões gênicas são altamente variáveis.  A família MGF100 consiste em 6 parálogos altamente diversos entre os genomas. Curiosamente, o genoma da cepa chinesa GZ2018 de ASFV contém apenas 4 genes diferentes da família MGF100 (MGF100-1R, MGF100-1 L, I7L e I8L), faltando os genes MGF100-2L e MGF100-3L.

É interessante testar as funções dos outros genes da família MGF100 no futuro.

Fonte: Development and in vivo evaluation of MGF100-1R deletion mutant in an African swine fever virus Chinese strain.

 

 




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