16 mar 2021

Antibiograma: importância da qualidade da amostra e diagnóstico laboratorial



AUTOR(ES)

Especialista em suinocultura

Anna Vilaró

Grupo de saneamento suinícola de Lérida (Espanha)

A introdução dos primeiros antibióticos na medicina foi de grande importância para avanços na saúde, porém, anos depois, as primeiras resistências aos antibióticos começaram a ser descritas.

O uso de antibióticos acelerou e continua aumentando o aparecimento de microrganismos resistentes, tanto na medicina veterinária quanto na humana.

Antibiograma: importância da qualidade da amostra e diagnóstico laboratorial

Em 2014, a Organização Mundial da Saúde (OMS) divulgou o primeiro relatório global sobre resistência a antibióticos, alertando para a grande ameaça que o uso exacerbado representa para a saúde global. É por isso que pesquisas são desenvolvidas constantemente sobre uso responsável de antibióticos.


Especificamente, na medicina veterinária, o papel do laboratório e do veterinário em fazer um bom diagnóstico é fundamental para se obter um estudo de sensibilidade antimicrobiana que sirva para tratar, quando necessário, cada caso clínico e poder superar com êxito uma infecção.

Para a realização de um estudo de susceptibilidade aos antimicrobianos, a primeira medida necessária é uma amostragem adequada e posterior isolamento das bactérias envolvidas.

IMPORTÂNCIA DA QUALIDADE DAS AMOSTRAS DESTINADAS AO LABORATÓRIO DE BACTERIOLOGIA

A execução correta da coleta, conservação e transporte são bases fundamentais para isolamento das bactérias patogênicas envolvidas no processo infeccioso.

Existem vários pontos-chave para realização de um bom diagnóstico:

Antibiograma: importância da qualidade da amostra e diagnóstico laboratorial

  1. Amostra representativa: Seleção de amostras representativas de animais com sintomas e que não receberam tratamento com antibióticos. Evite coletar amostras de animais com muitas horas de registro do óbito, para que não haja contaminação (autólise ou invasão post-mortem).
  2. Precisão e Precaução: A amostragem deve ser feita de forma minuciosa, amostrando apenas a área que se deseja analisar, tomando cuidado para não contaminar o material.
  3. Condições assépticas: As condições mais assépticas possíveis. É imprescindível o uso de luvas descartáveis, material estéril e desinfetantes tópicos, como a clorexidina.
  4. Conservação e transporte: As amostras para cultura bacteriológica devem ser mantidas refrigeradas e enviadas ao laboratório o mais rápido possível (máximo 48 horas). Este ponto é essencial, principalmente quando se deseja isolar uma bactéria incômoda como a Glaesserella parasuis,
    cuja viabilidade é afetada por fatores ambientais como temperatura ou tempo de transporte.
  5. Identificação da amostra: As amostras devem ser identificadas e armazenadas em recipientes estéreis e herméticos. Embora esse ponto seja bastante direto, muitas vezes falhas são cometidas na identificação das amostras ou as amostras são enviadas sem etiqueta, o que dificulta ao laboratório decidir, por exemplo, qual meio de cultura utilizar para a análise das amostras.

DIAGNÓSTICO BACTERIOLÓGICO

ETAPAS ANTERIORES AO ANTIBIOGRAMA
Assim que a amostra é recebida, o laboratório realiza o diagnóstico em 4 fases:

PROCESSAMENTO E INOCULAÇÃO DA AMOSTRA
A primeira fase consiste no processamento da amostra e inoculação em meios de cultura.

Com auxílio de um cotonete, retira-se a amostra de forma estéril e uma faixa é feita em um meio de cultura adequado para crescimento da bactéria.

 

 

GRAM STAIN

PURIFICAÇÃO DA CULTURA
A segunda etapa consiste em obter a cultura pura.

Nesta etapa, o principal interesse é o isolamento de bactérias patogênicas em uma cultura pura.

 

IDENTIFICAÇÃO
Em seguida, as bactérias são identificadas. Existem diferentes sistemas disponíveis, como a espectrometria de massa (MALDI-TOF Biotyper) que permite uma identificação muito rápida, bastando apenas alguns minutos para identificar uma bactéria. É o método utilizado em hospitais e atualmente vem ganhando espaço nos laboratórios de diagnóstico veterinário.

 

ANTIBIOGRAMA
A última etapa é a realização do antibiograma.

 

 

 

REALIZAÇÃO DO ANTIBIOGRAMA

Um antibiograma é um teste in vitro que permite determinar o perfil de sensibilidade de uma bactéria a um ou mais antibióticos.

Para isso, os laboratórios podem utilizar sistemas qualitativos ou quantitativos baseados na determinação da CIM (Concentração Inibitória Mínima).

 

                  Figura 2. Antibiograma por difusão em ágar (Kirby-Bauer). Leitura dos diâmetros dos halos de inibição.

ENSAIOS QUALITATIVOS 

KIRBY-BAUER

 

Em relação aos ensaios qualitativos, o sistema mais utilizado é o disco de difusão em ágar ou Kirby-Bauer.

Baseia-se na utilização de discos inoculados com uma concentração específica de um antibiótico e que, uma vez colocados na superfície de uma placa de cultura, se difundem radialmente.

A bactéria em estudo é inoculada em uma placa contendo um meio de cultura sólido específico para o cultivo (por exemplo, ágar Müeller-Hinton).

Os discos com os antibióticos de interesse são dispensados e as placas são incubadas por algumas horas a uma temperatura especificada (geralmente 18-24h a 35-37ºC).

Após a incubação, os diâmetros dos halos de inibição do crescimento que se formam ao redor do antibiótico são mensurados e, a partir da dimensão do diâmetro é possível determinar se a bactéria é sensível ou resistente a este antibiótico.

ENSAIOS QUANTITATIVOS 

Por outro lado, existem diferentes tipos de ensaios quantitativos pelos quais se determina a CIM (expressa em μg / ml ou mg / L), que é a menor concentração de antimicrobiano necessária para inibir o crescimento da bactéria in vitro. As técnicas mais utilizadas são:

MÉTODOS DE DIFUSÃO

 

E-test: são tiras que contêm uma concentração crescente de antibiótico.

Uma vez depositado em uma placa de cultura com a bactéria de interesse, o antibiótico se difunde criando um gradiente.

Após a incubação, um halo-elipse de inibição é formado onde o valor CIM será o ponto de intersecção do halo com a tira.

Figura 3. Estudo de sensibilidade antimicrobiana com tiras E-teste. Leitura CIM.

MÉTODOS DE DILUIÇÃO

 

Diluição em ágar sólido: são utilizadas placas com meio de cultura específico e cada uma contém uma concentração de antibiótico.

Adicionando as bactérias, veremos em que concentração a bactéria pode crescer e em que concentração seu crescimento é inibido.

Microdiluição: são utilizadas placas multipoços que contêm vários antibióticos em diferentes concentrações.

A Figura 4 ilustra as etapas a serem seguidas em laboratório. Resumidamente, uma concentração padronizada de bactérias é preparada em um caldo de cultura e adicionada a cada um dos poços (mesmo volume por poço).

As placas são incubadas a uma temperatura e duração específicas e a leitura é realizada posteriormente.

A menor concentração que inibiu o crescimento bacteriano será o CIM.

Este sistema é cada vez mais utilizado devido à existência de sistemas comerciais que permitem automatizar o processo e a leitura dos resultados.

Figura 4. Estudo de susceptibilidade antimicrobiana por microdiluição em placa de 96 poços (12 antibióticos e 8 diluições de antibiótico).

Macrodiluição: é um sistema semelhante ao anterior, a única diferença é que trabalha com volumes maiores.

Figura 5. Diagrama de um estudo de susceptibilidade antimicrobiana por macrodiluição em tubos de ensaio. As concentrações de antibióticos testados variam de 0,03 a 1mg / L. O CIM é igual a 0,5mg / L (primeiro tubo onde o crescimento bacteriano foi inibido).


INTERPRETAÇÃO DE ANTIBIOGRAMAS E CIM

USO DE ANTIBIOGRAMAS NO CAMPO

Uma vez obtidos os valores de CIM ou os diâmetros de inibição, é necessário interpretar os resultados, ou seja, fornecer uma categoria clínica (Sensível / Resistente).

O fato da bactéria isolada ser sensível a um determinado antibiótico significa que, se a infecção for tratada com esse antibiótico com o regime de dosagem registrado, espera-se um curso favorável da infecção.

Em contrapartida, a categoria resistente  significa que o uso desse antibiótico não mudará o curso da infecção. 

 

INTERPRETAÇÃO DOS RESULTADOS

Para atribuir uma categoria clínica, existem alguns documentos produzidos por organizações internacionais (CLSI e EUCAST) que estudam e estabelecem pontos de corte clínicos para que os laboratórios possam interpretar CIMs ou diâmetros.

Esses pontos de corte definem por quantos milímetros de diâmetro a bactéria será considerada sensível a um determinado antibiótico ou a partir de qual CIM a bactéria é resistente a um antibiótico.

Os pontos de interrupção são específicos para espécies, microrganismos e antibióticos.

Embora na medicina humana os pontos de corte sejam bastante estabelecidos, na medicina veterinária faltam muitos, o que dificulta a interpretação dos resultados em alguns casos.

CONCLUSÕES 

Os antibiogramas são uma ferramenta muito útil para o clínico, pois permitem prever o sucesso / fracasso de um tratamento individual, mas, ao mesmo tempo, permitem monitorar a resistência em uma granja ou pirâmide de produção.

Entretanto, é de grande importância que as informações fornecidas no antibiograma devem ser bem utilizadas. O relatório do laboratório serve como um guia, mas o médico veterinário é responsável por decidir qual terapia antimicrobiana é a mais adequada com base nos resultados laboratoriais, bem como, na sua experiência prévia e, claro, levando em consideração a categorização mais atual dos antibióticos (EMA, relatório AMEG, 2020).

Para concluir, observe que um antibiograma não adianta se vier de um diagnóstico errado. Portanto, vale continuar a enfatizar aos veterinários a importância da coleta de amostras completa e asséptica, apesar das dificuldades que podem ser encontradas em ambientes de granjas pouco estéreis.

Antibiograma: importância da qualidade da amostra e diagnóstico laboratorial

 

                                                                                                                  




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